马铃薯甲虫保幼激素合成与信号转导相关基因的克隆和功能分析

【摘要】马铃薯甲虫(Leptinotarsadecemlineata)是北美洲、欧洲和亚洲的大部分国家马铃薯上最重要的食叶害虫,也是我国对外重大检疫对象和重要外来入侵物种。严重发生时可致使马铃薯减产一半以上,甚至绝收。长期的农药防治使马铃薯甲虫的抗药性日渐增强,急需研究和开发新的防治技术。基因干扰(RNAi)作为新的科学研究手段,不仅可以用于基因功能的研究,还可以通过转基因的方式转入植物或者工程菌内,这为害虫防治提供了新的思路。保幼激素是调节昆虫生长发育的重要激素,而且只在昆虫等生物内存在。因此,研究保幼激素相关基因功能对昆虫生长发育的研究及害虫治理新措施的开发都具有重大意义。本文克隆了9个马铃薯甲虫保幼激素合成及信号转导途径相关基因的全长cDNA序列,并采用RNA干扰方法研究了3个合成相关基因被抑制后对幼虫的影响,确定这些基因是否能成为RNAi防治害虫的潜在靶基因。现将研究结果总结如下：1、马铃薯甲虫保幼激素合成相关基因的克隆根据家蚕和赤拟谷盗等基因组中已经公布的相关基因的信息,从马铃薯甲虫转录组中,获得了3条保幼激素合成相关基因片段,它们分别是：保幼激素酸甲基转移酶、法尼酸甲基转移酶腺苷高半胱氨酸水解酶。通过常规PCR,验证了这些基因片段的真实性,进而利用RACE技术,克隆出了这些基因的全长序列。通过氨基酸序列多重比对,发现这些基因与其他物种均有较高的相似性。同时,应用qPCR技术,测得了3个保幼激素合成相关基因不同发育期的相对表达量。这些基因的mRNA水平与马铃薯甲虫中保幼激素滴度变化基本一致。2、马铃薯甲虫保幼激素合成相关基因的RNA干扰效应通过大肠杆菌表达dsRNA的方法,对保幼激素合成途径中的保幼激素酸甲基转移酶、法尼酸甲基转移酶和腺苷高半胱氨酸水解酶3个基因进行了RNA干扰实验。结果表明,喂食保幼激素合成相关基因dsRNA之后,幼虫体内3个靶基因的表达量均显著下降。基因沉默使部分试虫死亡,部分幼虫表型异常,化蛹和羽化均受阻。保幼激素类似物吡丙醚可以部分补偿合成酶相关基因沉默产生的不利影响。3、马铃薯甲虫JH信号转导相关基因的克隆及干扰JH代谢基因对其表达的影响获得了6个保幼激素信号转导途径相关基因全长cDNA,它们分别是：核受体转录激活因子2、Kruppel-homolog1、烯虫酯耐受蛋白和Broad家族3个基因。摄入保幼激素合成相关基因dsRNA之后,部分保幼激素信号转导途径相关基因的表达量也有不同程度下调。而保幼激素类似物吡丙醚可以部分恢复转导途径相关基因的表达。总之,本实验的结果表明：喂食法是递送大肠杆菌表达的dsRNA的有效方法。这为基因功能研究和害虫治理提供了一条可能途径。
【作者】周立涛；
【导师】李国清；
【作者基本信息】南京农业大学，农业昆虫与害虫防治，2013，硕士
【关键词】马铃薯甲虫；保幼激素；合成；信号转导；RNA干扰；

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